线粒体的作用缺血预处理心肌保护作用的线粒体机制研究进展

向岑1 魏义勇2 王海英1

1遵义医科大学附属医院麻醉科 563000；2贵州省麻醉与器官保护基础研究重点实验室，遵义 563000

国际麻醉学与复苏杂志,2020,41(08):813-818.

DOI：10.3760/cma.j.cn321761-20191216-00102

基金项目

国家自然科学基金（81860062）；

贵州省卫健委科学技术基金（gzwjk j2019‑1‑093）

REVIEW ARTICLES

【综述】

缺血性心脏病是全世界首要的健康问题之一，每年在全球造成约820万人死亡和缺血性心力衰竭，给经济带来沉重负担。近年来，血管成形术、CPB下心内直视手术及溶栓术等得到普及，使缺血心肌得到早期复灌，但这些手术都不可避免发生心肌缺血/再灌注损伤（myocardial ischemia/reperfusion injury, MI/RI）。然而，在入院的急性冠状动脉综合征患者中，有6%的患者因为MI/RI而没能获救。因此，如何减轻MI/RI是重要的临床问题之一。

缺血预处理（ischemic preconditioning, IPC）是指在长时间缺血/再灌注前进行多次短暂缺血/再灌注，可使心肌组织对随后的缺血产生耐受性，减轻MI/RI。实验研究和临床实践均证明，IPC具有心肌保护作用，但具体机制尚不清楚。目前研究表明，IPC主要通过减少活性氧（reactive oxygen species, ROS）生成、抑制钙超载、激活G蛋白耦联受体、增加ATP生成、减少线粒体通透性转换孔（mitochondrial permeability transition pore, mPTP）开放等途径改善线粒体结构与能量代谢，最终发挥心肌保护作用。线粒体是心肌细胞生成ATP的主要场所，在维持心肌细胞能量代谢和离子稳态方面发挥着极为重要的作用，同时也被认为是研究MI/RI的主要细胞器。本文主要介绍IPC心肌保护作用的线粒体（离子通道、蛋白质、自噬）以及线粒体相关的基因机制。

线粒体的作用_线粒体立体结构示意图_线粒体颗粒

1 线粒体离子通道

线粒体为双层膜结构，膜上有许多离子通道，如线粒体膜ATP敏感性K+通道（mitochondrial membrane ATP‑sensitive potassium channels, mitoKATP）、大电导Ca2+激活K+通道（large‑conductance Ca2+‑activated K+channels, BKCa）、线粒体钠钙交换蛋白、线粒体钙离子单向转运蛋白和电压依赖性阴离子通道等，这些通道调节膜内外离子浓度，通过改变线粒体的结构与功能对心肌细胞产生影响。目前研究表明，这些通道在IPC抗MI/RI的作用中可能发挥了重要作用，这里我们主要介绍前3种通道。

1.1mitoKATP通道

mitoKATP通道存在于多种细胞膜，包括质膜、肌膜/内质网、线粒体以及核膜。mitoKATP通道是八聚体结构，由4个跨膜内向整流K+通道（inward rectifying potassium channel, KIR）亚基（KIR6.1/KIR6.2）和4个跨膜黄酰脲受体（sulfonylurea receptor, SUR）亚基（SUR1/2A/2B）组成。Mizumura等证实mitoKATP通道开放剂——比马卡林预处理可显著减少心肌梗死面积、增强腺苷释放和髓过氧化酶活性，其程度与IPC组几乎相同，这表明IPC主要是通过激活心脏mitoKATP通道介导抗MI/RI作用。短暂的缺血会增强腺苷释放并激活腺苷A2受体，从而增加一氧化氮（nitric oxide, NO）生成并打开mitoKATP通道。上升的腺苷水平也可能增加去甲肾上腺素的释放，激活mitoKATP通道。此外，NO增加会激活环氧合酶，从而增加前列腺素的形成，进而激活mitoKATP通道。近年来，远程缺血预处理（remote ischemic preconditioning, RIPC）成为抗MI/RI的主要干预措施，通过对远程组织行局部缺血和再灌注保护使器官免受MI/RI。RIPC可激活mitoKATP通道调节NO、环氧化酶以及NF‑κB等相关介质发挥心肌保护作用。因此，IPC通过一系列调控机制激活mitoKATP通道开放，从而调节线粒体功能发挥抗MI/RI作用。

1.2BKCa

BKCa是由基因Kcnmal编码线粒体的作用，故该通道也称为KCa1.1通道。Siemen等首次采用膜片钳技术发现胶质细胞线粒体内膜的线粒体大电导K+通道被Ca2+和电压激活。在肝脏线粒体中发现NS1619开放BKCa通道，该化合物在兔MI/RI模型中具有保护作用，提示线粒体大电导K+通道具有减轻MI/RI的作用。NS1619激活BKCa通道介导的心脏保护作用不能被mitoKATP通道拮抗剂5‑羟葵酸阻断，且该通道对二氮嗪也不敏感，这表明线粒体BKCa不同于mitoKATP通道。Soltysinska等证明在MI/RI之前给予BKCa剂量依赖性激动剂NS11021可以减少心肌梗死面积、提高左心室发展压。此外，激活BKCa可以降低左室舒张末期压力和改善血管缺血性痉挛，这表明激活BKCa可以提高心脏缺血期间的能量储备。Cao等利用离体灌流大鼠MI/RI心脏模型，通过BKCa抑制剂microMpaxilline（Pax）消除了IPC的保护作用。Frankenreiter等利用BKCa基因敲除小鼠建立MI/RI模型，研究心肌细胞线粒体中的BKCa介导IPC抗MI/RI的效应。结果表明，BKCa可以增强IPC的心肌保护作用。

1.3mPTP

mPTP位于线粒体内膜和外膜之间，细胞内环境发生变化时会影响其开放或关闭。缺血/再灌注期间引起的线粒体Ca2+超载、ROS大量生成、ATP生成降低、细胞内pH值变化等均可诱导mPTP开放。mPTP开放使得小分子穿透线粒体内膜，导致线粒体膜破裂、氧化磷酸化解耦联以及ATP耗竭线粒体的作用，最终引起细胞死亡。而且，mPTP开放还会引起线粒体基质肿胀、线粒体外膜破裂，诱导促凋亡因子（如细胞色素）从膜间隙释放至细胞质，从而引发细胞凋亡。IPC抑制mPTP开放是心肌保护作用的重要机制之一，目前IPC抑制mPTP开放的具体机制可能如下：① IPC激活mitoKATP通道，诱导线粒体膜电位去极化，减少线粒体Ca2+超载，从而抑制mPTP开放。然而，mitoKATP通道开放引起线粒体膜电位去极化这一观点有待进一步验证。② IPC维持线粒体外膜完整性，防止细胞色素从细胞质中流失，从而减轻氧化应激，抑制mPTP开放。③ IPC减轻缺血引起的细胞内酸中毒，抑制Na+‑H+交换体活性，从而减慢细胞内pH值恢复，降低细胞内Na+、Ca2+蓄积，可能通过此机制抑制mPTP开放。

线粒体的作用_线粒体立体结构示意图_线粒体颗粒

2 线粒体蛋白质

线粒体蛋白质参与机体许多生理过程，如电子传递、ATP合成、三羧酸循环和脂肪酸氧化等。线粒体结构与功能的改变与许多疾病相关，如心血管疾病、神经系统疾病等。研究表明，线粒体缝隙连接蛋白43（connexins, Cx43）、线粒体亲环蛋白（cyclophilin D, CyPD）和还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide reduced,NADH）脱氢酶1α亚复合体10亚基（NADH dehydrogenase 1α subcomplex 10 subunit, NDUFA10）在IPC心肌保护中具有重要作用。

2.1Cx43

Cx43是第一个被发现的连接蛋白单体，负责形成心脏六聚体半通道和缝隙连接通道，允许细胞间电流传导以及细胞内外小分子交换。Cx43在心肌细胞膜和心肌线粒体中丰富表达。线粒体Cx43主要存在于肌膜线粒体，调节线粒体呼吸功能、K+电流、线粒体内Ca2+稳态以及mPTP开放等，在维持线粒体功能和能量代谢中发挥重要作用。线粒体Cx43调节复合物I ，影响ROS和ATP的生成，进而增加线粒体以及细胞对长时间缺血/再灌注的耐受性，这对于IPC的心脏保护作用是必不可少的。研究发现，心脏经历5 min缺血/5 min再灌注，在2个循环后，线粒体Cx43表达水平升高，可预防再灌注引起的呼吸衰竭和氧化损伤，而线粒体Cx43表达降低则消除了IPC的心脏保护作用。线粒体Cx43的S‑亚硝化可以增加线粒体对K+的通透性，导致心脏中ROS生成增加。IPC增强线粒体Cx43的S‑亚硝化，这将心脏保护信号转导通路中的NO和Cx43串联起来。

2.2CyPD

CyPD是一种重要的线粒体伴侣蛋白，是肽基脯氨酰顺/反异构酶，参与线粒体蛋白质折叠。CyPD主要通过调节mPTP开放，使线粒体内膜去极化，进而减少ATP生成并增加ROS的产生。CyPD可以调控电子传输链组成，使其成为调控线粒体功能的中心节点。研究者利用CyPD+/‑小鼠IPC模型，通过蛋白印迹技术分析IPC期间CyPD是否介导激活蛋白激酶B（protein kinase B, Akt）和细胞外调节蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases,Erk1/2）发挥保护作用。结果表明，敲除CyPD小鼠在IPC刺激下Akt和Erk1/2磷酸化并没有显著增加，提示IPC诱导的蛋白激酶磷酸化依赖CyPD。目前尚不清楚CyPD如何调节mPTP，还需进行大量实验明确CyPD如何调控线粒体的分子生物学功能。

2.3NDUFA10

NDUFA10是电子传输链复合物Ⅰ的亚基，位于线粒体内膜。该蛋白具有NADH脱氢酶活性和氧化还原活性，将电子从NADH转移到泛醌，电子转移过程中释放的能量使质子穿过线粒体内膜，形成质子梯度，合成ATP。缺血/再灌注使电子传输链活性下降，从而导致还原性组分半衰期延长，诱导产生大量ROS、氧化损伤以及ATP生成障碍。学者通过建立兔心肌IPC模型，利用线粒体蛋白质组学研究发现，IPC组NDUFA10表达较缺血/再灌注组低，推测这种变化可能是由于IPC作为代偿措施保护线粒体功能。此外，魏义勇等通过mitoKATP通道开放剂吡那地尔后处理，发现NDUFA10有同样的变化趋势，认为mitoKATP通道开放，K+进入线粒体，激活线粒体电子传输链复合物I，诱导ROS生成减少，ATP生成增加，H+‑K+交换和H+‑Na+交换增强，细胞内和线粒体内酸中毒改善，机体所需代偿减弱，使NDUFA10表达增加程度减低。因此，NDUFA10极有可能是IPC心肌保护作用的靶蛋白。

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3 线粒体自噬

自噬是一种普遍存在的细胞分解代谢过程，通过吞噬和降解自体胞质蛋白或细胞器，从而满足细胞自身的代谢需要和细胞器的更新。线粒体自噬是在线粒体进行的一种特异性自噬，选择性清除受损线粒体以避免细胞死亡。MI/RI可导致线粒体功能障碍，表现为线粒体膜电位去极化和mPTP开放，导致ATP生成减少，ROS生成增多和促凋亡蛋白释放增加，引起细胞死亡。适度自噬可清除受损细胞器，挽救濒死心肌细胞。过度激活自噬却会引起细胞自噬性死亡。然而自噬在MI/RI中是否具有保护作用仍存在争议。Huang等利用Langendorff离体灌流大鼠心脏模型，使用冷冻切片荧光自噬体成像技术研究自噬在IPC心肌保护作用中的分子机制。结果表明，离体灌流大鼠心脏经历3×5 min全心缺血/再灌注，在第3个循环后，通过蛋白质印迹技术检测自噬蛋白水平，发现自噬蛋白表达上调。使用自噬特异性抑制剂——Tat‑ATG5K130R预处理，心肌梗死面积增大，表明自噬被抑制时IPC心肌保护效应降低。而孙超等则发现用自噬抑制剂——渥曼青霉素干预IPC，磷脂酰肌醇3激酶‑Akt‑雷帕霉素靶蛋白信号转导通路表达增强，抑制自噬，从而使IPC发挥抗MI/RI作用。因此，需进一步明确自噬在MI/RI中的作用及具体机制。

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4 线粒体相关的基因

4.1微RNA（microRNA, miRNA）

miRNA是一种内源性非编码小分子RNA，广泛存在于真核生物，在进化上具有高度保守性。近年来，大量研究显示miRNA是影响细胞增殖、分化、凋亡等病理生理过程的关键分子，可通过干预电信号转导、肌肉收缩、血管再生等方式参与抗MI/RI。研究证实，miR‑1和miR‑133分别通过Hsp60和Hsp70调节下游通路或靶点，在不同节点抑制线粒体凋亡。ADP‑核糖化因子蛋白2存在于线粒体腺嘌呤核苷酸转位酶1，调节线粒体结构的完整性。miR‑15可通过靶向调节Bcl‑2和抑制ADP‑核糖化因子蛋白2诱导凋亡。miR‑15过度表达可以导致心肌细胞线粒体变形和ATP生成减少，表明miR‑15参与调节细胞能量代谢。IPC可以调节miRNA家族表达，如miR‑1、miR‑21、miR‑24等表达上调。

4.2长链非编码RNA（long non‑coding RNA, lncRNA）

lncRNA是一类长度大于200个核苷酸分子的非编码RNA，通常不具有编码蛋白质能力，但lncRNA参与调节炎症、细胞凋亡和自噬。在小鼠MI/RI模型中，发现lncRNAs表达与miRNA有关。非编码RNA，如lncRNA和miRNA在心脏中表达丰富，在防治MI/RI的过程中发挥重要作用。miRNA通过与mRNA的3’‑UTR不完全结合，降低目标基因的表达，并影响其功能，lncRNA与miRNA竞争结合，形成lncRNA‑miRNA‑mRNA信号转导通路调节疾病，参与调节自噬、心肌细胞凋亡、氧化应激、炎症反应以及线粒体功能障碍等。从分子生物学的角度来看，IPC势必会引起lncRNA表达发生改变，这可能有益于改善线粒体的结构与功能。

4.3线粒体DNA（mitochondrial DNA, mtDNA）

mtDNA位于线粒体内膜，由相对分子质量16.5×103双链圆形DNA组成，不包含内含子，在电子传输链中编码13种多肽。mtDNA发生任何损伤都可能诱导线粒体功能异常，抑制氧化磷酸化。mtDNA在心血管疾病的发生、发展中起着重要作用，缺血性心脏疾病可导致mtDNA损伤，mtDNA损伤和修复能力缺失可能引起线粒体功能障碍和细胞凋亡。研究证实，受损的心肌细胞可释放mtDNA，mtDNA可作为危险相关分子，与模式识别受体相互作用引发炎症和组织损伤。Xie等利用大鼠缺血/再灌注模型探索mtDNA的心肌保护作用机制，发生急性心肌缺血时，mtDNA释放入血液循环，作为危险相关分子激活TLR9‑p38丝裂原活化蛋白激酶通路，增强MI/RI。然而，IPC是否引起mtDNA功能改变尚不清楚。推测IPC可以抑制mtDNA损伤，增加ATP生成，改善线粒体功能和心肌细胞能量代谢，进而发挥心脏保护作用。

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5 展望

线粒体在许多信号转导途径中具有核心作用，通过改善线粒体结构和能量代谢减轻MI/RI是目前心肌保护策略的有效方法之一。随着蛋白质组学和基因组学等研究手段的发展，为研究IPC的心肌保护作用机制提供了重要手段。IPC主要通过调节线粒体相关离子通道、线粒体蛋白质、线粒体自噬以及线粒体相关基因发挥保护作用。因此，深入研究IPC心肌保护作用的线粒体机制有望为抗MI/RI的临床研究提供实验基础。

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